bioRxiv | 新型冠状病毒中刺突蛋白近原子电镜结构解析

撰文 | 十一月

责编 | 栾晓东

新型冠状病毒2019-nCov的爆发引起了人们对于此突发性公共卫生事件的高度关注。冠状病毒的刺突糖蛋白（Spike glycoprotein, S glycoprotein）是疫苗、治疗性抗体的研发以及临床诊断的关键靶点。

为了协助对该流行性疾病进行医学防护措施研发，2020年2月15日，美国卫生总署(NIH)与德克萨斯大学奥斯汀分校Jason S. McLellan研究组（McLellan组在病毒结构方面做了很多重要的工作，包括MERS等，有着丰富的经验）进行合作在预印版平台bioRxiv发表文章Cryo-EM Structure of the 2019-nCoV Spike in the Prefusion Conformation，利用冷冻电镜技术分析了新型冠状病毒表面S蛋白的近原子结构。另外作者们通过生物物理以及结构方面的证据发现，SARS-CoV-2的S蛋白结合人体ACE2（宿主细胞受体血管紧张素转化酶2）【1,2】的亲和力要远高于SARS-CoV的S蛋白，解释了新型冠状病毒传染性之强的主要原因。

新型冠状病毒是会引发发热、严重呼吸道疾病及肺炎的人传人的病原体【3,4】。截止到发稿时间，感染人数已经超过五万人。而新型冠状病毒与17年前爆发的严重急性呼吸综合征冠状病毒极为相似【5,6】。而且，相较于SARS来说，新型冠状病毒的更加快速的人传人并迅速传播到各个大洲的现象使得世界卫生组织将此次疫情爆发列为国际关注的突发公共卫生事件【7】。

新型冠状病毒利用高度糖基化的同源三聚体S蛋白进入宿主细胞。S蛋白经历结构变化将病毒融合进入宿主细胞的细胞膜。此过程包括病毒的S1亚基结合到宿主细胞受体上，引发三聚体不稳定性的发生，进而造成S1亚基脱落S2亚基形成高度稳定的融合后结构【8】。

图1 新型冠状病毒结构域分布示意图

为了对新型冠状病毒的S蛋白预融合的结构进行解析，作者们利用已经公开的2019-nCoV的序列（图1）通过亲和层析和凝胶排阻层析进行体外蛋白纯化。通过收集和处理3,207张蛋白图像后，作者们对蛋白进行了3D结构重组，获得了3.5 Å分辨率的“向上”蛋白质结构（图2）。为了接近宿主细胞受体，S1亚基中的受体结合结构域（Receptor-binding domain，RBD）会经历铰链类似的构象移动用以隐藏或者暴露受体结合的关键位点。“向下”结构代表了受体不可结合状态，而“向上”结构则代表了受体可结合状态，“向上”结构处于较为不稳定的状态【9】。通过该结构分析，作者们发现S1亚基中的RBD经历铰链类似运动，此移动特点与SARS-CoV以及MERS-CoV均非常相似，但新型管冠状病毒中则RBD结构则更靠近三聚体的中央部位，其S蛋白中3个RBP中的1个会向上螺旋突出从而让S蛋白形成能够轻易与宿主受体ACE2结合的空间构象。这也说明，新型冠状病毒引发病毒的机制虽然与其他的冠状病毒科的病毒机制异曲同工，但传染性更强。

图2 新型冠状病毒预融合结构

将新型冠状病毒S蛋白的结构与SARS的S蛋白结构进行比较后作者们发现，两者之间结构最大的不同位于“向下”结构中的RBD结构域(图3 绿色结构区域)之中。SARS 的S蛋白中“向下”结构中RBD紧贴NTD结构域。虽然存在结构上的不同，但是整体上来说，新型冠状病毒与SARS-CoV在结构上还是高度相似的。

图3 新型冠状病毒与SARS-CoV的结构异同比较

除了SARS病毒之外，新型冠状病毒与蝙蝠冠状病毒RaTG13在S蛋白中序列同源性高达96%。但新型冠状病毒S蛋白中最显著的变化是具有S1/S2蛋白酶切割位点的“RRAR”（弗林蛋白酶识别位点）氨基酸序列，而不是像SARS病毒中仅具有单个精氨酸【10】。这一现象在流感病毒中较为普遍，其中高毒力禽流感病毒和人流感病毒常发生流感血凝素蛋白的关键位置上产生多聚弗林蛋白酶位点的氨基酸插入。除了在S1/S2连接处的氨基酸残基差异外，新型冠状病毒和RaTG13 S蛋白还存在29个氨基酸残基的差异，其中17个位于受体结合的RBD部位。另外，先前有报道发现新型冠状病毒与SARS病毒共享形同的宿主细胞受体ACE2【2】，作者们希望进行动力学方面的检测以进一步确认两者之间的不同。令人惊讶的是，新型冠状病毒结合ACE2的亲和力要远高于SARS病毒的亲和能力（>10-20倍）（图4）。新型冠状病毒对ACE2的高亲和力也进一步解释了该病毒能够快速人传人的原因【3】。

图4 新型冠状病毒病毒对于ACE2具有高亲和性

由于新型冠状病毒与SARS病毒之间的结构同源性，作者们希望对已经发表的SARS病毒的RBD单克隆抗体对新型冠状病毒的RBD进行交叉反应性测试。但是作者们发现，尽管两病毒RBD之间结构高度相似，但是SARS病毒的RBD抗体对于新型冠状病毒并没有明显的结合。SARS RBD的单克隆抗体对于新型冠状病毒不具有交叉反应，该结果与为新型冠状病毒S蛋白作为未来抗体分离与治疗方案的设计提供了重要的参考。

总的来说，Jason S. McLellan研究组的工作从近原子的分辨率对新型冠状病毒的S蛋白进行了解析，为进一步精确地疫苗设计以及抗病毒药物的发现提供了重要的结构生物学基础，大大促进了全球对于新型冠状病毒相关医疗对策的发展。

在文章上传到BioRxiv之上后，迅速引发了科学家们对于此结构生物学文章的关注。博士生Daniel Wrapp与博后Nianshuang Wang是文章的共同第一作者，为了文章中新型冠状病毒病毒S蛋白结构的迅速解析付出了重要努力。另外针对于S蛋白的疫苗已有VRC/NIAID（变态反应和感染性疾病研究所疫苗研究中心）的科学家进行研发和测试。

部分内容引自微博用户@子陵在听歌

原文链接：

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.02.11.944462v1

参考文献

1. Li, W. et al. Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus. Nature 426, 450-454, doi:10.1038/nature02145 (2003).

2. Hoffmann, M. et al. The novel coronavirus 2019 (2019-nCoV) uses the SARS-coronavirus receptor ACE2 and the cellular protease TMPRSS2 for entry into target cells. 2020.2001.2031.929042, doi:10.1101/2020.01.31.929042 %J bioRxiv (2020).

3. Chan, J. F. et al. A familial cluster of pneumonia associated with the 2019 novel coronavirus indicating person-to-person transmission: a study of a family cluster. Lancet, doi:10.1016/S0140-6736(20)30154-9 (2020).

4. Chen, N. et al. Epidemiological and clinical characteristics of 99 cases of 2019 novel coronavirus pneumonia in Wuhan, China: a descriptive study. Lancet, doi:10.1016/S0140-6736(20)30211-7 (2020).

5. Lu, R. et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet, doi:10.1016/S0140-6736(20)30251-8 (2020).

6. Wu, F. et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature, doi:10.1038/s41586-020-2008-3 (2020).

7. Li, Q. et al. Early Transmission Dynamics in Wuhan, China, of Novel Coronavirus-Infected Pneumonia. N Engl J Med, doi:10.1056/NEJMoa2001316 (2020).

8. Walls, A. C. et al. Tectonic conformational changes of a coronavirus spike glycoprotein promote membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A 114, 11157-11162, doi:10.1073/pnas.1708727114 (2017).

9. Walls, A. C. et al. Unexpected Receptor Functional Mimicry Elucidates Activation of Coronavirus Fusion. Cell 176, 1026-1039 e1015, doi:10.1016/j.cell.2018.12.028 (2019).

10. Belouzard, S., Chu, V. C. & Whittaker, G. R. Activation of the SARS coronavirus spike protein via sequential proteolytic cleavage at two distinct sites. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 5871-5876, doi:10.1073/pnas.0809524106 (2009).